骨发育与再生中Gli1+细胞维持H型血管的作用如何？

维持稳定的骨改建依赖于多种因素协同，但这种稳态会由于人体衰老、药物干预、系统性疾病、创伤等因素的影响而改变，出现骨质疏松和骨缺损等，造成种植术区骨量不足。临床医生为恢复术区骨量则需要采取包括块状骨移植术和引导骨再生术等方法通过骨再生达到骨增量的目的，然而，成骨必须基于有效的再生能力和充分的血供条件。

因此，在骨增量过程中如何提高再生能力和血供成为骨再生研究领域中的一个重要方向。干细胞作为种子细胞在组织再生领域处于核心地位。在骨形成过程中，骨髓间充质干细胞分化形成新的成骨细胞及前体细胞，对骨折愈合、骨内稳态有重要作用。有报道指出间充质干细胞能够广泛分布于组织器官的基础是其能够富集于血管周围的壁龛。

2014年Kusumbe等发现了一种高表达CD31和omucin信号并与成骨高度偶联的H型血管，证明其是参与成骨过程的特异型血管，并且是生理性骨发育和病理性骨再生当中的关键调节靶点，提示H型血管的作用及其与成骨的关系是骨再生研究的重要切入点。但是，这种血管亚型和成骨关系密切的原因及作用机理仍然缺乏认识。

缺氧诱导因子-1α是控制血管生成的重要因子，可调控伤口愈合和肿瘤中的血管生成，其表达和活性受到缺氧环境的调控。在激烈的骨改建或再生活动中，相对缺氧的环境会影响区域内各种类型细胞的HIF-1α表达。内皮细胞中的HIF-1α是H型血管形成的重要启动因素，因此其在调节H型血管形成过程中起着至关重要的作用。

由于Gli1+细胞作为血管周细胞参与骨发育和再生修复，那么HIF-1α对于H型血管和成骨的调控是否与Gli1+细胞之间存在联系？因此有必要深入探讨Gli1+细胞在HIF-1α介导的成血管和成骨过程中的作用及机制，以期为骨再生过程中间充质干细胞及血管的调控策略提新的供理论基础。

使用Gli1-LacZ、Gli1-CreERT2和ROSA26-mT/mG模式动物模型标记Gli1+细胞；对小鼠骨组织进行冰冻切片制作，利用免疫荧光染色技术标记目标抗原信号，激光共聚焦显微镜多层扫描重建Gli1+细胞、H型血管等信号表达情况；流式分析技术分析骨内目标细胞数量。

使用上述方法，构建骨发育模型获得生理状态下Gli1+细胞与H型血管空间分布关系和变化趋势数据；构建骨缺损模型获得病理性骨再生中Gli1+细胞与H型血管变化趋势；通过骨缺损后不同时间点观察，获得在缺损愈合初期Gli1+细胞与H型血管的分布变化规律。

构建Gli1-CreERT2和ROSA26-DTA模式动物体内敲除Gli1+细胞；Gli1抑制剂GANT61抑制Gli1+细胞；利用骨组织冰冻切片技术进行组织学观察，使用IF和CLSM技术获得H型血管、成骨信号、干细胞信号等表达情况，利用FC分析骨内细胞数量及变化趋势。

利用以上技术，构建骨发育模型获得生理状态下Gli1+细胞对H型血管的影响；构建骨缺损模型获得病理再生中Gli1+细胞对H型血管的影响；利用Notch信号通路抑制剂抑制H型血管，研究H型血管对Gli1+细胞影响。管腔形成实验研究BMMSCs、Gli1+细胞对内皮细胞成管腔能力影响。

构建Gli1-LacZ模式动物模型标记Gli1+细胞；构建Gli1-CreERT2和ROSA26-DTA模式动物体内敲除Gli1+细胞；Gli1抑制剂GANT61抑制Gli1+细胞；使用甲磺酸去铁胺促进HIF-1α活性，HIF-1α抑制剂抑制HIF-1α活性。

分离培养BMMSCs并进行成骨诱导分析HIF-1α和Gli1+细胞在成骨中的作用，通过碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力，实时定量基因扩增荧光检测检测成骨基因表达，蛋白质免疫印迹检测成骨蛋白表达；苏木素-伊红染色判断骨组织学变化；显微断层扫描技术检测Gli1+细胞和HIF-1α介导的骨量变化。

IF、CLSM技术检测荧光信号表达量信号和细胞数量。利用上述方法，体内调控HIF-1α信号并构建骨发育和损伤模型获得生理和病理状态下Gli1+细胞、H型血管、成骨等指标的变化。体外管腔形成实验研究Gli1+细胞、HIF-1α对ECs成管腔能力的影响。

在小鼠骨内发现H型血管分布区域内存在丰富的干细胞信号表达，且Gli1+细胞表达这些信号，继而发现Gli1+细胞在H型血管周围特异性富集的现象。通过不同年龄小鼠对比，确认了Gli1+细胞与H型血管在骨发育中同步变化的趋势，且在生理状态二者依然保持紧密空间分布。

利用骨缺损模型，发现骨再生过程中干细胞信号、Gli1+细胞、H型血管信号全部呈激增趋势，并确认在病理状态下Gli1+细胞和H型血管依然保持密切分布关系。通过缺损后多时间节点观察，发现在缺损恢复初期Gli1+细胞首先出现在再生区域并逐渐扩增而H型血管从四周逐渐向内部迁移的规律。

通过模式动物手段在生理状态下敲除Gli1+细胞，发现干细胞信号大量下调，流式分析显示骨内干细胞亚群下降明显，组织学研究确认了骨干骺端和骨干部H型血管和成骨信号显著下调，这说明发育中Gli1+细胞对H型血管有维持作用。

在病理模型中敲除Gli1+细胞，骨愈合初期H型血管的形成和骨再生中H型血管数量都明显受到抑制，同时成骨信号、干细胞信号也明显下调，证实骨缺损再生修复过程中Gli1+细胞仍然对H型血管有关键作用。

此外，体外管腔形成实验中，敲除Gli1+细胞或Gli1抑制剂GANT61预处理的BMMSCs促ECs管腔形成能力也显著下降。另一方面，运用DAPT抑制H型血管，Gli1+细胞及其成骨信号并没有改变，表明本实验中H型血管对Gli1+细胞无明显影响；同时DAPT处理的BMMSCs促管腔形成能力与对照组无统计学差异。

通过体外诱导BMMSCs成骨，发现敲除Gli1+细胞或使用Gli1抑制剂GANT61处理会导致BMMSCs成骨能力下调。体内实验观察到发育和再生过程中，Gli1+细胞敲除导致小鼠骨质疏松，进一步验证了Gli1+细胞在成骨中有重要作用。

DFM处理上调HIF-1α信号可以促进BMMSCs成骨分化能力，骨再生及骨质疏松模型中注射DFM亦可促进成骨，骨髓间充质干细胞分化形成新的成骨细胞和前体细胞。

通过模式动物手段敲除Gli1+细胞后，DFM的促成骨分化能力、促H型血管形成能力以及促ECs管腔形成能力皆大幅抑制，骨缺损后再生修复被明显阻断，证明Gli1+细胞是HIF-1α信号介导的成血管和成骨进程中的关键细胞基础。

骨骼血管网是细胞、氧、营养物质和代谢废物转运循环的重要载体，受到多因素调控，血管的形成由来自于软骨细胞及其他骨细胞提供的信号调控,其中比较典型的信号是血管内皮细胞生长因子，另外，骨内血管内皮细胞对于微环境也具有较为独特的调控作用。血管细胞与骨相关细胞有密切关系，在新骨形成时发挥重要作用。

同样，在骨折愈合过程中血管的形成也十分关键。另外，血管的变化会导致骨骼系统疾病，据报道人类骨骼系统微血管网的变化会导致造血功能障碍，与原发性骨质疏松、老年骨质疏松有密切联系。因此，骨内血管网特殊功能的研究具有重要意义。

在小鼠骨髓腔中，血管具有差异化的形态及分布，主要包含进入骨骼的动脉血管、广泛分布于骨内的毛细血管以及出骨髓腔的静脉血管。窦状毛细血管组成了多分叉不规则的血管网络，其最初被发现于骨髓腔中的造血细胞周围。

而一些小动脉及缺少细小旁分支的血管从股骨或者胫骨头进入，其中，小动脉形态较为笔直，由平滑肌细胞所覆盖，由骨皮质进入骨髓腔。在骨髓腔内，一部分平直分叉很少的动脉血管延伸至干骺端生长板时出现大量的分叉；其中，大部分小动脉终止于干骺端生长板的附近，另一些远端的小动脉终止于骨内膜的毛细血管。

静脉血管位于骨干中部，与干骺端毛细血管相连，由皮质骨出骨髓腔。在这种结构下，动脉中的氧气和富营养的血液优先供给干骺端生长板附近，其作用可以影响局部新陈代谢的状态。

另外，干骺端生长板附近的含氧量也高于骨干部分，同样，对血管形成发挥积极作用的HIF-α在干骺端也更为富集。Kusumbe等认为，在干骺端动脉以及毛细血管连接区域的血管分布特性导致了该区域含氧量以及新陈代谢活性的差异，说明在该区域分布的血管可能具有潜在的特殊功能。

2014年，Kusumbe等在小鼠骨髓腔的毛细血管中，通过对整个毛细血管网的成像，揭示了毛细血管拥有两种不同结构的亚型，并通过血管灌注等试验方法观察到，内皮细胞组成的毛细血管在干骺端呈长柱状形态，与远端弓状或环状血管相互联系；相反，骨干部的毛细血管形成高分叉的形态，与窦窦状隙毛细血管形态一致。

在干骺端与骨干部分移形处，二者相互连接。这两种形态存在差异的血管在表面分子的表达上也存在特异性。干骺端呈现管柱状的血管内皮细胞以及骨内膜上的血管内皮细胞高表达CD31和omucin。

而骨干内部毛细血管低表达CD31和稍弱的omucin信号，这种高表达CD31、EMCN的血管内皮细胞亚型可以与CD31、EMCN低表达的血管内皮细胞通过荧光染色清晰地区别。在骨髓腔中，细小的动脉高表达CD31却低表达EMCN，其延伸至干骺端并终止于高表达CD31、EMCN的血管。

用流式细胞技术可以确认，这种高表达CD31、EMCN的血管内皮细胞仅仅占骨内内皮细胞的一小部分。这说明在骨内，血管在空间结构与表型上存在非均质性。Kusumbe等根据结构和表型差异，将这种高表达CD31、EMCN信号的血管亚型被命名为H型血管，而相对应的低表达CD31、EMCN信号的血管亚型被命名为L型血管。

这种差异化的血管类型为我们后期对骨内生理病理条件下成骨成血管的研究打下基础，并给骨内血管研究提供了新的指标。骨骼系统的毛细血管可以在形态、功能、分子层面被细分亚型，其中的H型血管存在于动脉网的远端，其为骨内该区域提供特异性的代谢环境，使其富含更多的氧气和营养，对新陈代谢和生长至关重要。

H型血管有多种功能，其内皮细胞可以调控局部血管网生长，并可能提供信号给血管周围的成骨细胞前体细胞；此外，在激素调控的骨量改变中H型血管可能发挥作用。据报道，在衰老小鼠中雌激素缺乏会导致骨质疏松，但是同时使用雌激素干预可以促进成血管，Kusumbe等推测其机理可能与雌激素缺乏条件下H型血管和相关的成骨细胞下调有关。

H型内皮细胞的发现对于揭示骨发育、衰老、再生过程中血管和成骨的关系起到桥梁作用；同时，在临床检测中，H型血管可能作为骨内血管生长状态和成骨能力的诊断指标，对于骨折愈合过程中骨量丧失的治疗具有潜在指导作用。